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支原體PCR檢測(cè)試劑盒的操作步驟

發(fā)布日期: 2017-01-06
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    支原體PCR檢測(cè)試劑盒中含有PCR反應(yīng)所需要各種試劑組分,如:引物、dNTPs、緩沖液、Taq酶、穩(wěn)定劑等。PCR反應(yīng)液中加入檢測(cè)樣品和Taq酶,即可進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳染色判斷,陽性樣本將在290bp處出現(xiàn)特異性條帶。
    1.收取待檢樣品(貼壁細(xì)胞:細(xì)胞生長(zhǎng)至80%左右即可,送檢細(xì)胞不能用消化液消化細(xì)胞,可以使用細(xì)胞刮刀刮取細(xì)胞;懸浮細(xì)胞:細(xì)胞生長(zhǎng)至80%左右即可),取150ul(約1~3×105細(xì)胞數(shù))至離心管,沸水浴10min 。 
    2.將煮沸過的細(xì)胞懸浮液12000rpm離心2-5min。 
    3.取上清4ul作為PCR反應(yīng)模板。 
    4.充分融化PCR反應(yīng)液,按下列表格配制反應(yīng)混合液,并以21ul/管分裝至PCR反應(yīng)管中。
    5.每個(gè)PCR反應(yīng)管中加入處理好的樣品4ul,DNA陽性對(duì)照和陰性對(duì)照各加入4ul/管。 
    6.將所有PCR反應(yīng)管放入PCR儀,參照以下參數(shù)運(yùn)行PCR儀。
    7. 取5ul PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,在1%瓊脂糖凝膠上直接點(diǎn)樣(注:無需再加溴酚藍(lán),擴(kuò)增產(chǎn)物已包含溴酚藍(lán)),120V電泳20分鐘(可根據(jù)電泳儀的情況,適當(dāng)調(diào)整參數(shù))。 
    8. EB染色觀察。 
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